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李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一种食源性胞内菌模型病原体，给食品行业带来了严峻的挑战，它能够在各种环境条件下持续成长，在孕妇、老年人和免疫功能低下的人中感染非常严重。细胞内李斯特菌的免疫清除率取决于CD8+ T 细胞介导的细胞毒性反应；因此，有效的疫苗应该能够引发强大的细胞免疫。这种疫苗开发的一个关键是阐明受感染细胞上呈递的表位和抗原库；然而，关于李斯特菌T细胞表位的研究非常缺乏。
今天为大家分享一篇2024年8月发表在MPC上的文章，文章的题目是“Immunopeptidomics Mapping of Listeria monocytogenes T Cell Epitopes in Mice”。作者基于质谱的免疫肽组学筛查了感染小鼠脾脏中呈递的李斯特菌免疫肽，鉴定了6000多条在MHC I类分子呈递的免疫肽，包括12个高度可信的李斯特菌肽，这些肽来自12种不同的细菌蛋白。研究团队进一步通过实验验证了这些肽中VTYNYINI激活CD8+ T细胞的能力，揭示了其作为一种新的李斯特菌CD8+ T细胞表位的潜力，并评估了其在增强模型中的生物活性，从而证明了免疫肽组学在细菌抗原鉴定中的有效性。
研究方法
作者使用C57BL/6小鼠，以3例李斯特菌感染和3例未感染的生物重复样品富集MHC I类免疫肽。将每个重复样品中纯化的免疫肽分成两部分，以无标记方式直接通过LC-MS/MS分析，或在TMT标记和离线预分馏后进行分析，以增强免疫肽检测。对于TMT标记样本，未感染的样品用129N、130N和131N TMT标记，而李斯特菌感染的样品用132N、133N和134N标记。
使用LC-MS/MS质谱技术进行免疫肽鉴定，PEAKS®️ Studio 11.0软件进行数据解析，鉴定与HLA I分子结合的免疫肽，以FDR 1%进行过滤，感染样品中强度较高的李斯特菌肽被标记为高置信度细菌肽。而对于小鼠呈递的免疫肽，T检验用于选择在感染样本中显着上调的肽。合成并鉴定细菌肽，筛选新型李斯特菌CD8+ T细胞表位，并验证生物学效力。实验方法流程可参见图1。
图1. 免疫肽鉴定实验流程简介
研究结果
1.筛选李斯特菌感染小鼠中呈递的 MHC I类肽
使用 PEAKS®️ Studio 11进行数据库搜索，共鉴定出6928种肽，包括6891种小鼠自身肽和37种李斯特菌肽，其中通过无标记和TMT标记鉴定的共有肽段1709条（24.7%），说明两种方法的互补性。从鉴定的肽段长度分布、预测的结合亲和力和基序分析均说明了免疫肽鉴定数据集的高质量。
图2. 李斯特菌感染后小鼠MHC I 类免疫肽的鉴
2. 检测高可信度李斯特菌免疫肽
作者鉴定的李斯特菌肽有一半（13/26）是7-mer，与MHC I类分子无结合。去除7肽长度免疫肽后，作者合成了剩余的13种李斯特菌肽，比较实验碎裂光谱与合成对应物的光谱差异，结果显示除ISGSRLSI外，所有肽的合成和实验谱图均显示出高度重叠，皮尔逊相关系数在0.67和0.99之间，证实了细菌免疫肽鉴定的正确性。
在合成的12个高置信度肽，有11个的8-mer或9-mer。除李斯特菌肽外，许多小鼠自身肽在感染样品中强烈上调。功能分析显示，正如预期的那样，这些蛋白质通常参与抗原呈递和免疫相关过程。研究发现，IEDB中没有记录任何高可信度的李斯特菌表位，但作者从LMON_0611蛋白检测到一个9-mer肽，这是一种细菌蛋白。在鉴定的12种李斯特菌蛋白中，作者发现5种蛋白（42%）与细胞质膜相关，1种蛋白（LMON_0611）与细胞壁相关，3种蛋白与细胞质相关，3种蛋白亚细胞位置未知。鉴于28%的李斯特菌蛋白被预测为膜相关蛋白因此我们观察到此类外周蛋白的相对富集，这些外周蛋白可能更容易获得并进行呈递。
图3. 检测高可信度的李斯特菌免疫肽
3. 筛选新型李斯特菌CD8+T细胞表位
作者进一步探讨了新鉴定的李斯特菌免疫肽是否能够激发特定的T细胞反应。CD8+ T细胞表位不仅通过与MHC类I分子结合来定义，还通过它们与T细胞亚群的反应或激活能力来确定。为了解决这个问题，作者使用致死剂量的ΔactAΔinlB-L对小鼠进行免疫。七天后，从免疫小鼠中收集的脾细胞，在体外用最终浓度为1μM 5种候选表位在体外刺激免疫小鼠的脾细胞5小时，并检测CD8+细胞IFN-ɣ和TNF表达作为抗原特异性的检测。候选表位是根据其预测的强MHC结合（VTYNYINI和IAIGVIGL）或非常高的合成光谱相关性（GGLLSIGI、AEHAIALAKD、VGTLTEQI）来选择的。此外，作者选择高可信三种7-mer李斯特菌免疫肽（SVIGIDL、IVLPSLL、MVIPIIL）作为阴性对照。结果显示，源自 LMON_0576的VTYNYINI肽，预测为强结合H2Kb表位，免疫后IFN-ɣ+、TNF+CD8+ T细胞占比最多，表明它可能作为来自李斯特菌的真正新表位，而其他候选表位被刺激至与阴性对照相似的水平。
图4. MHC I类免疫肽的CD8+T细胞反应
4. LMON_0576免疫肽的生物效力
CD8+ T细胞表位肽是抗原特异性CD8+ T细胞产生细胞因子的极强刺激剂，在体外测定中具有pmol-fmol范围内的生物活性。为了评估LMON_0576免疫肽的生物效力，作者用DC-0576或DC-0033肽免疫小鼠，并用ΔactAΔinlB-L单核细胞增强免疫。加强后7天，用滴定量的同源肽刺激个体小鼠的脾细胞，终浓度从100nM到100fM。所有接受DC-0576李斯特菌增强刺激的小鼠都对CD8+ T细胞的同源肽产生IFN-ɣ+、TNF+反应。在用LMON_0033免疫肽刺激的小鼠中，未检测到IFN-ɣ+、TNF+ CD8+T细胞。LMON_0576免疫肽浓度低于10pM时，仍可在高于背景的条件下检测到IFN-ɣ+、TNF+ CD8+T细胞，与先前鉴定的真正的MHC I类限制性表位的生物效力一致。
图5. MHC I 类免疫肽生物效力
5. LMON_0576免疫接种保护实验
作者用DC-0576肽引发了三组小鼠（图6）。第一组为在初免后16天不进行免疫加强（DC prime）的阴性对照，第二组为接受ΔactAΔinlB-L单核细胞增生增强（DC prime LM boost）的阳性对照，第三组DC-0576引发的小鼠用含有2μg编码LMON_0576抗原的密码子优化mRNA的LNP疫苗（DC Prime LMON boost）加强。在加强后8天确定DC Prime 和DC Prime LMON增强组中LMON_0576衍生肽特异性CD8+ T 细胞反应，并在 DC Prime LMON增强组中升高。然后在初始免疫后第38天用致死剂量的毒力李斯特菌攻击免疫小鼠和年龄匹配的幼鼠，并在3天后测定脾脏和肝脏中的细菌数量（图6D）。受感染的幼鼠在脾脏和肝脏中都有很高的细菌载量，而正如预期的那样，接受李斯特菌增强治疗的小鼠在两个器官中的细菌数量都很少。相比之下，DC Prime或DC Prime LMON boost 组的小鼠在脾脏或肝脏中表现出对感染的控制。因此，虽然我们提供了强有力的证据表明LMON_0576衍生肽是来自李斯特菌的真正的MHC I类限制性表位，但对该表位具有特异性的CD8+ T细胞无法提供对感染的可测量控制。
图6. LMON_0576 抗原的 mRNA-LNP 疫苗进行 DC-0576启动和加强后的保护性免疫评估
结论
通过免疫肽组学技术在李斯特菌感染的小鼠模型中成功鉴定出12个新的李斯特菌免疫肽高杠杆炒股票，特别是VTYNYINI肽段，它能够激活CD8+ T细胞，显示出作为一个新的李斯特菌T细胞表位的潜力。尽管VTYNYINI肽段在增强模型中表现出高生物活性，能够诱导特异性的CD8+ T细胞反应，但它并未能在小鼠挑战实验中提供对李斯特菌感染的保护，表明这一表位虽有作为研究工具的价值，但不足以作为疫苗开发的候选。这项研究强调了免疫肽组学在细菌抗原发现中的潜力，并为未来的疫苗设计和免疫学研究提供了新的视角。
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